قسمت مورد نظر از DNA را که می تواند بخش های مختلف باشد از جمله ژن ،پروموتور ، ترمیناتور ، توالی های کوزاک  ، اپرون و ... را در ابتدا باید اماده کرد.

ابتدا قسمت مورد نظر باید از منبع خود ( ژنوم میزبانش ) برش بخورد . کار قیچی در مهندسی ژنتیک را آنزیم های محدود کننده انجام می دهند که در ادامه به تفصیل آمده است .

سپس با روش های مختلف می توان قطعه را تکثیر کرد .

وسپس چسباندن قطعه مورد نظر به وکتور به جهت ادامه مسیر . درمهندسی ژنتیک بعضی از آنزیم ها مثل  چسب عمل می کنند که در ادامه به تفصیل آمده است .

آنزیم های محدود کننده یا(restriction enzyme) : این آنزیم ها قسمت مشخصی از توالی DNA  را می شکافند و یک قطعه DNA را با دو  انتهای  مشخص تولید می کنند . دو انتهای ایجاد شده  می تواند بصورت صاف blunt"  " یا چسبنده "sticky" باشند . برای ایجاد DNA  نوترکیب انتهای چسبنده کارامد تر است . انزیم های نام برده جایگاه  خاص برش  درون مولکولی خود ( restriction sites) را پیدا کرده و شکاف ایجاد می کنند . با وجود اینکه این آنزیم‌ها در باکتری‌ها  یافت می شوند.، برای آنها  DNA مورد نظر مربوط به چه موجودی باشد تفاوتی ندارد.  ایجاد شکاف از طریق قطع پیوند بین فسفات و قند نوکلئوتید های مجاور صورت می گیرد. در اینجا پرسشی مطرح می شود که چگونه DNA  باکتری از هضم آنزیمی در امان می ماند ؟ DNA ژنومی باکتری با وجود  آنزیم اصلاح کننده (متیل ترانسفراز) محافظت می شود و از برش جلوگیری می شود.از این رو انزیم های نام برده  برای انجام مراحل  مهندسی ژنتیک بسیار حائز اهمیت می باشند . بیش از 800 مورد از آنها به صورت تجاری در دسترس هستند و در ازمایشگاها به منظور کلون سازی مورد استفاده قرار می گیرند.

EcoRI digestion produces "sticky" ends,

whereas SmaI restriction enzyme cleavage produces "blunt" ends:

انزیم های محدود کننده بر اساس کارایی در 5 گروه  دسته بندی می شوند. ( Types I, II, III, IV, and V)

حامل ( ناقل ، وکتور، پلازمید  ) :

اصطلاح پلاسمید در سال 1952 توسط بیولوژیست مولکولی آمریکایی جاشوالدربرگ برای اشاره به "هر عامل تعیین کننده ارثی خارج کروموزومی" معرفی شد .پلاسمید به  مولکول DNA اطلاق می گردد که معمولا بصورت حلقوی بوده وخارج ازکروموزوم درون سلولی است ومهمترین ویژگی آن  استقلال در تکثیر است زیرا دارای ، منشاء همانندسازی DNA origin، ژن مقاومت به آنتی‌بیوتیک  وجایگاه برش چندگانه Multiple Cloning Site  و  تمامی ملزومات جهت همانندسازی و تکثیر می باشد پلاسمید ها برهنه هستند و برخلاف ویروس ها فاقد پوشش پروتئینی می باشند . پلاسمید ها معمولا در باکتری ها یافت می شود و از ابزار اساسی در مهندسی ژنتیک و ژنتیک مولکولی به حساب می ایند .

DNA LIGAZE:

DNA لیگازها  نوعی از آنزیم ها محسوب می شوند که مانندچسب عمل می کنند . این آنزیم ها با تشکیل پیوند فسفو دی استر سبب اتصال دو نوکلیوتید  و اتصال زنجیره های DNA به هم می شوند .بعضی از آنها شکستگی دو رشته را و برخی دیگر شکستگی در تک رشته ها را ترمیم می کنند. این آنزیم ها کاربرد های گسترده ای از جمله  در ترمیم و همانند سازیDNA   همچنین در مهندسی ژنتیک به جهت تولید مولکول نوترکیب دارند.

به منظور اتصال ژن مورد نظر به پلاسمید جهت انتقال به سلول باکتریایی ، باید ژن تکثیر گردد. می توان ژن را هم بصورت مصنوعی سنتز و یا با طراحی پرایمر و از طریق چرخه PCR ژن را تکثیر کرد.

پرایمر( ( primer:

یکی از عوامل کلیدی برای سنتز DNA در موجودات مختلف پرایمر ها هستند . پرایمر یک اسید نوکلئیک تک رشته ای کوتاه است که آنزیم‌های DNA پلیمراز (مسئول تکثیر DNA) فقط قادر به افزودن نوکلئوتیدها به انتهای 3 انها هستند و قبل از اینکه DNA پلیمراز بتواند یک همانند سازی رشته مکمل را شروع کند، نیاز به اتصال پرایمر به الگو دارد. طراحی پرایمر نیاز به دقت و مهارت بسیار دارد از جمله مواردی که باید در طراحی پرایمر ها دقت شود شامل دمای ذوب و دمای اتصال  ، تعدادنوکلئوتید ها ، نوع بازها و جایگاه اتصال است. در موجودات زنده جنس پرایمرها از mRNA   بوده و در شرایط ازمایشگاهی برای سنتز پرایمر به علت پایداری از DNA  استفاده می شود.

وکتورها بعنوان یک ابزار اصلی در مهندسی ژنتیک دارای ویژگی هایی هستند که در ادامه به ان خواهیم پرداخت.

منشا همانندسازی Origin of Replication:

DNA   پلیمراز و سایر فاکتور‌های همانند سازی باید بتوانند محل آغاز همانند سازی را تشخیص دهند . تکثیر همیشه در مکان‌های مشخصی روی DNA شروع می‌شود و توالی‌های آن‌ها اغلب شناخته شده هستند.معمولا در این مناطق باز های A,T بیشتر به چشم می خورد. این مسئله به علت پیوند ضعیف تر هیدروژنی بین این دو باز است. در داخل هسته که مکان اصلی همانند سازی می باشد پروتئین های تخصص یافته ای وجود دارند که جایگاه شروع رونویسی را پیدا کرده و باهمکاری سایر پروتئین ها کار خود را اغاز می کنند. برای این منظور باید پیوند های هیدروژنی دو رشته باز شود و تعدادی پروتئین ، این مسئولیت را بر عهده دارند .پروتئین هایی نیز وجود دارند که دو رشته را از هم دور نگه می دارند تا اتصال مجدد روی ندهد .  اصطلاحا به این مکان ها حباب همانند سازی گفته می شود که در ان ناحیه در دو جهت مخالف سنتز و همانند سازی رشته جدید صورت می گیرد.

ژن مقاومت به آنتی‌بیوتیک Antibiotic Resistance Gene:

پلاسمید ها به داخل سلول های مستعدد به منظور کلون و یا بیان منتقل می شوند . برای تشخیص اینکه کدام سلول  حاوی پلاسمید است از ویژگی مقاومت ان در برابر انتی بیوتیک استفاده می شود . تنها باکتری‌های حاوی این پلاسمید، در حضور آنتی‌بیوتیک می‌توانند رشد کنند. ژن مقاومت آنتی بیوتیکی باید تحت کنترل یک پروموتر باکتریایی باشد تا با استفاده از دستگاه رونویسی باکتریایی در میزبان باکتری بیان شود.

جایگاه برش :

در پلاسمیدهای بیانی  جایگاه برشی اغلب در پایین دستِ پروموتر قرار دارد تا بیان آن توسط پروموتر کنترل ‌شود. این سایت‌های شناسایی آنزیم‌های محدود کننده در MCS، منحصر به فرد هستند و در جای دیگری در بدنه پلاسمید قرار ندارند.

ناحیه پروموتر:

پروموتر فراهم کننده شرایط برای  رونویسیِ ارگانیسم یا گروهی از موجودات خاص طراحی شده است. میزبان بر روی انتخاب پروموتور بسیار موثر است . برخی پروموتور ها بصورت اختصاصی در ناحیه خاصی عمل می کنند. برای بیان بالا و سرعت ان انتخاب پروموتور قوی بسیار حیاتی است.