اولین گام در خالص سازی پروتئین، آزادسازی پروتئین ها از غشاهای سلولی است. از سانتریفیوژ می توان برای به دست آوردن جمعیت غنی شده از سلول های هدف یا اندامک های سلولی استفاده کرد. سپس این سلول ها یا اندامک های سلولی برای آزادسازی پروتئین ها نیاز به لیز شدن (شکستن غشاهای آنها) دارند. لیز سلولی را می توان با شوینده های شیمیایی یا با روش های فیزیکی مانند فراصوت به دست آورد. پس ازاین مرحله، به منظور حذف بقایای سلولی از سانتریفیوژ استفاده می شود.
انواع روش های تخلیص
1.Salting out (solubility)
- Dialysis (size)
- Gel-filtration chromatography (size)
- Ion-exchange chromatography (charge)
- Affinity Chromatography (binding affinity)
- در روش نمک زدایی با افزایش غلظت نمک، پروتئین هایی با حلالیت کمتر از محلول رسوب می کنند.
- در این روش لوله دیالیز را می توان با اندازه منافذ مختلف بر اساس وزن مولکولی (دالتون یا کیلو دالتون) تهیه کرد. پروتئین های زیر محدوده وزن مولکولی MWCO) ) از نمونه به دیالیز خارج می شوند. پروتئین های بزرگتر که وزن مولکولی بالای MWCO دارند در غشای دیالیز باقی می مانند.
- در این روش یک رزین متخلخل تهیه می شود و محلول پروتئینی از آن عبور می کند. پروتئین های کوچکتر وارد دانه ها می شوند و مسیر آهسته تری را در رزین طی می کنند. پروتئین های بزرگتر در فضاهای بین مهره ها حرکت می کنند و ابتدا شسته می شوند.
- این روش بر اساس نقطه ایزوالکتریک پروتئین است که توسط ترکیب اسید آمینه تعیین می شود. اگر یک پروتئین در pH 7 بار مثبت کلی داشته باشد و پروتئین دیگری در pH 7 بار منفی کلی داشته باشد، آنگاه پروتئین با بار مثبت به ستونی با بار منفی جذب می شود و می تواند از پروتئین دیگر جدا شود.
- این روش از محفظه های اتصال در پروتئین و شناسایی مولکول های خاص بهره می برد. برخی از نمونه‌ها عبارتند از میل ترکیبی بیوتین-استرپتاویدین، برچسب‌های His، کروماتوگرافی پروتئین A/G و برهمکنش‌های آنتی‌بادی-آنتی‌ژن.
